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| 产地 | 美国/中国 |
| 品牌 | xuanya |
| 货号 | XY-PCR-1603 |
| 保存条件 | 常温 |
| 英文名称 | Cell Lysate RT-PCR Kit |
| 保质期 | 一年个月 |
产品及特点：
免RNA提取RT-PCR试剂盒是一种免 RNA 提取的 RT-PCR 试剂盒，它使用精心优化的细胞裂解液直接裂解培养细胞，然后直接在细胞裂解液中进行 RT，再用 cDNA 进行 PCR或荧光定量 PCR。本产品特点如下：
1. 免 RNA 提取，从细胞裂解到 RT-PCR 或实时定量 RT-PCR 结果只需三个步骤，省略了整个 RNA 提取过程。
2. 灵敏度不低于常规方法（先提总 RNA 再进行 RT-PCR），不但可以检测到低拷贝的 RNA，还可用于检测 miRNA。
3. 整合了去除基因组 DNA 的步骤，只检测 RNA，无需担心基因组 DNA 的污染。
4. 每次只需要 10-100000 个培养细胞或含相应细胞数的痕量组织（如 LCM样品），验证过的细胞包括 Hela、CHO、293、COS-7 等，但不能用于U937 细胞系。
5. 两步法 RT-PCR，后续使用灵活。得到的 cDNA 既可用于普通 PCR，也可用于基于 SYBR 的荧光定量 PCR，也可用于其他定量 PCR（如 TaqMan），非常灵活。
6. 即适用于少量样品，也适用于平行处理大量样品及高通量筛查。
7. 本产品足够用于 50 次 20μL 体系的 RT 和 600 次 30μL 体系（或约 200 次100μL 体系）的 PCR。
规格及成分：
| 成 分 | 十孔盒包装 |
| 溶液 A | 25 mL |
| 溶液 B | 0.5 mL |
| MMLV 逆转录酶 (含 RI) | 100 μL |
| RT Buffer（含 dNTP） | 300 μL |
| PCR MagicMix 3.0(含染料) | 9 mL |
| RNase-free 水 | 10 mL |
| 使用手册 | 1 份 |
运输及保存：低温运输，-20℃保存，有效期两年。
自备试剂：RT 引物、PCR 引物对
使用方法
注意：无 RNase 的环境和使用无 RNase 污染的试剂是本实验成功的关键。 强烈建议使用天恩泽的固相 RNase 清除剂去除工作台面的 RNase，用气相 RNase 去除空气中的 RNase。实验前需要将 95%乙醇放-70℃预冷，*用空 枪头盒盛乙醇。
一、细胞培养、裂解 1. 按常规方法培养细胞、胰酶消化并计数。 2. 转移 1×10E5 个细胞到离心管中，400×g 离心 4 分钟。 3. 吸弃上清（即培养基），保留细胞沉淀。 4. 用 0.5 mL 溶液 A 重悬细胞，并将细胞浓度调整到 2×10E5 细胞/mL。 5. 转移 10 μL 的悬浮细胞到 0.2 mL PCR 管中，并加入 10 μL 的溶液 B，此 时细胞终浓度为 10E5 细胞/mL。 6. 迅速将离心管插入浮子中，放入-70℃预冷的、95%乙醇中 1-3 分钟。10 μL 枪头盒一般能让 0.2 mL 的 PCR 管一半没入到乙醇中。 7. 在室温的水浴锅中快速解冻细胞，涡旋 10 秒后短暂离心数秒，将管中液体 （细胞裂解液）转移到新的离心管中，放冰上待用。 二、RT（逆转录）反应合成 cDNA 8. 按下表设置 RT 反应体系（以 20 μL 体系为例）:
| 成分 | 样品管 | 阴性对照管 |
| 细胞裂解液（含 RNA） | 2.5 μL | 2.5 μL |
| RT Buffer（含 dNTP） | 6 μL | 6 μL |
| MMLV 逆转录酶（含 RI） | 2 μL | 无 |
| RT 引物(100ng/μL) | 1 μL | 1 μL |
| RNase-free 水 | 补水到 20 μL | 补水到 20 μL |
9. 42℃保温 60 分钟。此步为 RT 反应。 10. 70℃保温 10 分钟以终止反应，然后放冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作 为 PCR 模板使用，不需要纯化。也可以放置在-20℃长期保存。 三、PCR 方案一（RT 产物全部用于 PCR） 11.在上步的 RT 反应管中直接按下表加入各成分（以 100 μL 体系为例）：
| 成分 | 每管加入量 |
| PCR MagicMix 3.0（已加染料） | 50 μL |
| 自备正向 PCR 引物 (100 ng/μL) | 2 μL |
| RNase-free 水 | 补水到 100 μL |
12.直接进入第 14 步。
四、PCR 方案二（部分 RT 产物用于 PCR）
13.按下表设置 PCR 反应体系（以 30 μL 体系为例）：
| 成分 | 每管加入量 |
| PCR MagicMix 3.0（已加染料） | 15 μL |
| cDNA 样品（RT 反应产物） | 1-5 μL |
| 自备正向 PCR 引物 (100 ng/μL) | 1 μL |
| 自备反向 PCR 引物 (100 ng/μL) | 1 μL |
| RNase-free 水 | 补水到 30 μL |
注意：RT 引物可以用做反向 PCR 引物。
14. PCR 反应参数(需要根据模板和引物 Tm 值决定，下面的参数只做参考)：
| 过程 | 温度 | 时间 |
| 预变性 | 94℃ | 5 min |
| PCR 反应 （35 个循环） | 94℃ | 1 min |
| 55℃ | 1 min | |
| 72℃ | 2 min | |
| *延伸 | 72℃ | 10 min |
四、电泳检测 15.取 5-10 μL PCR 产物直接在琼脂糖凝胶上电泳，跟分子量标准比较估计出 扩增产物的大小。注：本试剂盒中的 PCR mix 含有甘油和染料，可以直接 上样，不需要额外再加电泳上样液。
