【中文名称】甲型流感病毒荧光PCR检测试剂盒(IAV)

【英文名称】Influenza A virus (IAV) nucleic acid detection kit (RT-PCR fluorescence probe method)

【产品及特点】

甲型流感病毒荧光PCR检测试剂盒(IAV)是基于荧光染料检测的即用型 PCR 试剂盒，可以对靶片段进行实时定量PCR 分析（quantitative PCR、qPCR）。产品含有经过优化的缓冲液组分、Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2及新型荧光染料 DNAgreen 等所有实时定量 PCR 所需要的成分，用户只需加入模板和引物即可进行实时定量 PCR 反应和 HRM 分析，具有广泛的用途。

1. 方便，用户只需准备模板和引物既可以进行实时定量 PCR 实验和 HRM（High Resolution DNA Melt Curve Analysis）分析。而基于 SYBR Green I 和 LC Green 染料的 qPCR mix 则不能同时用于上述两种实验。

2. 使用第三代饱和型荧光染料，信号强，不会抑制 PCR 反应。

3. 快捷，即用型的预配液使加样操作步骤大大简化，避免了交叉污染，降低实验误差。

4. 各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。能检测到浓度为 50 拷贝/mL 的靶分子。

甲型流感病毒荧光PCR检测试剂盒(IAV)【规格及成分】

甲型流感病毒荧光PCR检测试剂盒(IAV)【运输及保存】

低温运输，-20℃保存, 保存期限为 6 个月。

【产品图片】

【自备试剂】

DNA 模板、引物、超纯水。

【使用方法】

1. 以 20 uL 的 qPCR 反应体系为例：在一干净的 PCR 管中，加入下列成分：

放入荧光 PCR 仪中进行扩增, 并在退火或延长步骤中记录荧光信号。

注意：

a) 通常引物浓度以 0.2 μM 可得到较好结果，可以终浓度 0.1-1.0 μM 作为设定范围的参考；通常 DNA模板的量以10-100 ng基因组 DNA或1-10 ng cDNA为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定*的模板使用量。

b) ROX 校正染料：如果使用 ABI 公司的 7500，7700 和 7900 三种型号的荧光 PCR 仪器，则需用自备的 ROX 进行 Ct 值校正。对 ABI 7700 和 7900，ROX 的*浓度为 1×（即在每 20 uL 反应体系中加 2 uL 10×ROX）。对ABI 7500， ROX 的*浓度为 0.05-0.1×（每 20 uL 反应体系加 0.1-0.2uL 10×ROX；也可将 10×ROX 稀释到 1×，然后每个反应体系加入 1-2 uL1×ROX）。ROX 会在溶解曲线中产生噪音，因此，如果出现了杂峰，将软件中“Passive Reference Dye”中的“ROX”选项取消打勾，然后重新分析数据。

对于 iCycler IQ，MJ Opticon，MJ Chromo4，MX3000，MX4000, RotorGene3000，RotorGene 6000 和 LightCycler 480 等型号的荧光PCR 仪器，ROX 不是必须的，但加入的话也不会影响整个 PCR 分析。

2. 循环步骤：根据扩增子的性质和仪器性能，从以下三个过程中任选一个进行扩增。

A：两步快速循环法：适用于引物 Tm 值设计为 60℃的反应

注意：本产品所采用的热启动酶须在预变性 95℃、10 min 条件下实现酶的活化。

退火温度请以 60-64℃作为设定范围的参考，发生非特异性反应时，可提高退火温度。

B：三步快速循环法：适用于延伸步骤温度高于退火步骤的 PCR（长引物 PCR）

甲型流感病毒荧光PCR检测试剂盒(IAV)注意：

a) 退火温度：建议采用两步法 PCR，退火温度 60℃进行反应。若提高反应特异性，可提高退火温度，以 60-64℃作为设定范围的参考。若因使用 Tm 值较低的引物等原 因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法 PCR 扩增，三步法的退火温度请以 56℃-64℃的范围作为设定参考。延伸温度：延伸温度设为 72℃通常可以提高扩增效率。但是，对于 AT 含量大于 70%的扩增子来说，延伸温度设为 60℃为宜。

C：通用循环法：这种循环方法适用于几乎所有的荧光 PCR 仪，也适用于用快速循环法不能扩增的模版。

3. 数据采集

具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在没结合 DNA 时，*吸收光谱在 471nm，结合 DNA 时的*吸收光谱在 500nm，*发射光谱在530nm。

其他注意事项：

1. 如果使用 iCycler，可以不加入 FAM。

2. 如果使用Roche LightCycler的玻璃毛细管进行PCR，需加入终浓度为0.5mg/mL的自备 BSA。

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