【中文名称】乙型脑炎病毒荧光PCR检测试剂盒(JEV)

【英文名称】Japanese encephalitis virus (JEV) nucleic acid detection kit (RT-PCR method)

【产品图片】

【自备试剂】

DNA 模板、引物、超纯水。

【使用方法】

1. 以 20 uL 的 qPCR 反应体系为例：在一干净的 PCR 管中，加入下列成分：

放入荧光 PCR 仪中进行扩增, 并在退火或延长步骤中记录荧光信号。

注意：

a) 通常引物浓度以 0.2 μM 可得到较好结果，可以终浓度 0.1-1.0 μM 作为设定范围的参考；通常 DNA模板的量以10-100 ng基因组 DNA或1-10 ng cDNA为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定*的模板使用量。

b) ROX 校正染料：如果使用 ABI 公司的 7500，7700 和 7900 三种型号的荧光 PCR 仪器，则需用自备的 ROX 进行 Ct 值校正。对 ABI 7700 和 7900，ROX 的*浓度为 1×（即在每 20 uL 反应体系中加 2 uL 10×ROX）。对ABI 7500， ROX 的*浓度为 0.05-0.1×（每 20 uL 反应体系加 0.1-0.2uL 10×ROX；也可将 10×ROX 稀释到 1×，然后每个反应体系加入 1-2 uL1×ROX）。ROX 会在溶解曲线中产生噪音，因此，如果出现了杂峰，将软件中“Passive Reference Dye”中的“ROX”选项取消打勾，然后重新分析数据。

对于 iCycler IQ，MJ Opticon，MJ Chromo4，MX3000，MX4000, RotorGene3000，RotorGene 6000 和 LightCycler 480 等型号的荧光PCR 仪器，ROX 不是必须的，但加入的话也不会影响整个 PCR 分析。

2. 循环步骤：根据扩增子的性质和仪器性能，从以下三个过程中任选一个进行扩增。

A：两步快速循环法：适用于引物 Tm 值设计为 60℃的反应

注意：本产品所采用的热启动酶须在预变性 95℃、10 min 条件下实现酶的活化。

退火温度请以 60-64℃作为设定范围的参考，发生非特异性反应时，可提高退火温度。

B：三步快速循环法：适用于延伸步骤温度高于退火步骤的 PCR（长引物 PCR）

乙型脑炎病毒荧光PCR检测试剂盒(JEV)注意：

a) 退火温度：建议采用两步法 PCR，退火温度 60℃进行反应。若提高反应特异性，可提高退火温度，以 60-64℃作为设定范围的参考。若因使用 Tm 值较低的引物等原 因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法 PCR 扩增，三步法的退火温度请以 56℃-64℃的范围作为设定参考。延伸温度：延伸温度设为 72℃通常可以提高扩增效率。但是，对于 AT 含量大于 70%的扩增子来说，延伸温度设为 60℃为宜。

C：通用循环法：这种循环方法适用于几乎所有的荧光 PCR 仪，也适用于用快速循环法不能扩增的模版。

3. 数据采集

具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在没结合 DNA 时，*吸收光谱在 471nm，结合 DNA 时的*吸收光谱在 500nm，*发射光谱在530nm。

其他注意事项：

1. 如果使用 iCycler，可以不加入 FAM。

2. 如果使用Roche LightCycler的玻璃毛细管进行PCR，需加入终浓度为0.5mg/mL的自备 BSA。

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