围产期组织间充质基质细胞的组织特异性分化潜能
2018-12-06

人类围产期组织是间充质基质细胞(MSC)的丰富来源,并且缺乏伦理问题。围产期MSCs可以从羊膜,绒毛膜和脐带等各种组织中获得。然而,鲜为人知的是每种MSC类型的独特性质。在这项研究中,我们成功地从羊膜(AMSCs),绒毛膜(CMSCs)和脐带(UC-MSCs)中分离和培养了MSC。其中增殖潜力不同,由于膜联蛋白V和衰老相关的β-半乳糖苷酶阳性细胞增加,AMSCs显示出最低的增殖率。我们使用微阵列根据原始组织的来源证明了明显的特征性基因表达。特别是,与凋亡和衰老相关的基因包括CDKN2A在AMSC中上调。在CMSCs中,与心脏形态发生和血液循环相关的基因(包括HTR2B)被上调。与神经系统过程相关的基因(包括NPY)在UC-MSC中上调。定量RT-PCR证实了基因表达数据。并且MSC的体外分化证明CMSCs和UC-MSC分别具有更显着的分化为心肌细胞和神经细胞的能力。该研究首次证明了围产期MSCs的先天性组织特异性分化潜能,这有助于选择更适当的细胞来源以在特定疾病中获得更好的结果。



间充质基质细胞(MSC)具有在体外和体内自我更新,免疫调节和分化成中胚层谱系的潜力。目前,MSCs被认为是再生医学应用的重要资源。它们可以从各种组织类型中分离,包括骨髓(BM),肺,脂肪,肝脏,脐带血,羊水,胎盘和脐带。的MSC还可以从人足月围产期组织,包括羊膜和绒毛膜获得的1,2。从脐带获得的MSCs已经揭示在体外增殖潜能和免疫调节功能3,4。人类术语围产期组织通常在出生后丢弃。因此,这些组织可以有效地用于研究和临床应用,而不会违反道德规范。该组织的大尺寸提供了MSC的高量,而其明显的免疫调节特性,这些决定了组织的再生医学最有前途的资源4,5。

人羊膜来源的MSC(AMSC),绒毛膜来源的MSC(CMSC)和脐带来源的MSC(UC-MSC)通常粘附在塑料上; 形成成纤维细胞集落形成单位; 精心制备特异性表面抗原模式CD90 +,CD73 +,CD105 +,CD45 -,CD34 -,CD14 -和HLA-DR - ; 可区分脂肪形成,软骨形成,成骨或血管/内皮细胞系中的一种或多种; 和表示成人和胚胎干细胞(ESC)之间的中间阶段5,6,7。已经报道了来自各种组织的MSC之间的差异,例如可溶性因子分泌与AMSC和CMSC的血管生成/免疫抑制功能之间的差异8。绒毛膜板衍生的MSC和UC-MSCs在分化成脂肪细胞,骨细胞和肝细胞等不同细胞类型方面的潜力不同9。MSC的起源或来源可决定其命运和功能特征。在临床使用之前,需要更好地理解各种MSC的独特特征。

由于AMSC,CMSC和UC-MSC可以同时从一个供体获得,因此可以探索其固有特征,同时最小化人际变异。然而,目前关于它们的不同特征和基因表达谱的信息很少。分析基因表达谱是一种强有力的方法,可用于了解特定来源的MSCs向特定谱系分化的倾向和能力。我们假设来自不同来源的MSC将展示其自身的基因表达谱,其解释了它们的独特特征,例如分化谱系和/或采用某种细胞命运。

该研究有四个目的:1)分离和表征来自不同人类围产期组织的AMSC,CMSCs和UC-MSC; 2)比较细胞增殖,免疫表型和中胚层分化潜能的差异; 3)检查他们的基因表达谱并研究他们的差异; 4)确定每种MSC型的分化潜能。发现MSC类型的特定效力可以导致更有效的方法来选择针对特定目的的细胞。



MSC的分离和增殖

我们成功地从羊膜,绒毛膜和脐带中分离并培养了MSC。在原代培养(P0)中,将AMSC与纺锤形细胞和上皮样细胞混合。上皮样细胞在P1处消失,并且纺锤形细胞维持至P2(图1A)。CMSCs和UC-MSCs在P1处呈梭形细胞并保持其形态至P9或P10。两种AMSC在P5处停止增殖,并且在P7处停止一种AMSC。在培养期间评估AMSC,CMSC和UC-MSC的增殖潜力。P3处的AMSC,CMSC和UC-MSC的平均PDT分别为68±22.5小时,28.2±3.2小时和26.1±2.2小时。在传代过程中,AMSCs,CMSCs和UC-MSC的PDT值增加(图1B)。与CMSC(P ?= 0.011)和UC-MSC 相比,AMSCs增殖缓慢(P ?<0.001)。CMSCs的增殖活性与UC-MSCs的增殖活性相当(P ?= 0.110)。与CMSC(3.9%)和UC-MSC(1.4%)相比,膜联蛋白V阳性细胞的百分比在AMSC中最高(26.7%)(图1C)。AMSCs在3种围产期MSCs中表现出最低的增殖率和最高的膜联蛋白V表达。与CMSC(10.5%)和UC-MSC(11%)中的SA-β-gal阳性细胞相比,AMSC中SA-β-gal阳性细胞的百分比也最高(87.5%)(图1D)。



(A)羊膜原代间质基质细胞(AMSCs)在原代培养,第3代和第6代(左),绒毛膜MSCs(CMSCs)(中)和脐带间充质干细胞(UC-MSCs)(右)在原代培养,传代中的形态学3和10(x40)。(B)AMSC,CMSCs和UC-MSC之间的群体倍增时间的比较。(C)通过膜联蛋白V-FITC / PI染色评估细胞凋亡,然后进行流式细胞术分析。(D)通过β-半乳糖苷酶活性测定评估衰老。(E)来自羊膜(AMSC),绒毛膜(CMSCs)和脐带(UC-MSC)的间充质基质细胞的中胚层分化潜能。脂肪生成(油红O),软骨形成(阿尔新蓝),成骨(硝酸银)(x100)。


MSCs的中胚层分化潜能

我们进一步评估了暴露于成骨,脂肪形成或软骨诱导条件下的AMSC,CMSC和UC-MSC的分化潜能。培养3周后,来自三个围产期组织的MSC能够分化成脂肪细胞,软骨细胞和骨细胞(图1E)。当与BM-MSC相比时,通过油红O染色明显的脂滴显示三种围产期MSC的脂肪形成诱导。与BM-MSC相比,通过茜素红S染色,成骨诱导显示在围产期MSC中矿化基质的积累较少。

MSC表型标志物的表达

为了证实来自三个围产期组织的分离和培养的细胞对应于MSC 10,我们测试了几种MSC表型标志物的表达,包括CD105,CD90和CD73。正如预期的那样,所有MSCs无论其组织来源如何均为间充质标记物的表达阳性,对造血谱系标记物(包括CD11b,CD34,CD45,CD79a和HLA-DR)呈阴性,从而满足MSC鉴定的标准(图 S1) )。

使用RT-PCR评估茎的性质

我们观察到与干性相关的基因的mRNA表达,例如OCT4,NANOG和SCF,其对于维持茎潜力是重要的。HLA-ABC和HLA- G的,样品中检测到。TERT未在任何样品中表达